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监控高风险环境

来源:老子有钱下载官网   发布时间:2019-11-26   点击量:452

监控高风险环境

发明提供监控高风险环境的方法,通过检测样品中存在或缺乏cpn60标记来监控微生物的存在或缺乏。

在抗体测定中,抗体本身或与其结合的二抗能可检测地标记。另外,抗体可缀合生物素,可检测地标记的抗生物素蛋白(结合生物素的蛋白)可用于检测生物素酰化抗体的存在。这些方法(包括“多层”测定)的组合对本领域技术人员熟悉,可用于提高测定的敏感性。这些测定中的一些(例如免疫组织学方法或荧光流式细胞仪)可应用于组织学切片或未裂解的细胞悬浮液。下述检测液体样品中cpn60特异多肽的方法也可用于检测细胞裂解物中的cpn60特异多肽。

应理解尽管上面诊断测定的描述指对食物样品或体液样品的测定,测定也可在本文所列任何其它流体或溶解样品上完成,如水样品或缓冲液样品(例如用于从污染物中提取样品的缓冲液)。

图5是来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的cpn60基因序列(SEQ IDNO:5;GenBank登录号NC_003198)。本文所述通用cpn60引物可杂交的序列(或其互补物)加下划线。

检测或定量可检测标记的方法取决于标记性质且在本领域已知。适当标记无限制地包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H、32P、33P或14C)、荧光部分(例如荧光素、若丹明或藻红蛋白)、发光部分(例如Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA提供的QdotTM纳米粒)、吸收确定波长光的化合物或酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。由适当酶催化的反应产物可以无限制地是荧光、发光或放射性,或它们能吸收可见光或紫外线。探测器例子可无限制地包括X光胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、发光计和光密度。

原位杂交前,变性细胞内所含探针和染色体DNA。变性一般通过孵育进行,孵育时存在高pH、热(例如从约70℃到约95℃的温度)、有机溶剂如甲酰胺和四烷基卤化铵或其组合。例如,变性染色体DNA可通过高于70℃的温度(例如约73℃)与变性缓冲液的组合,缓冲液含70%甲酰胺和2X SSC(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠)。一般确定变性条件,从而保护细胞形态。探针可通过热变性(例如通过加热到约73℃,或约5分钟)。

以mRNA为基础的测定另外,为测试样品如含细胞的样品中cpn60特异mRNA的存在或缺乏或者测量其水平,可裂解细胞并通过多种本领域已知方法从裂解物中纯化或半纯化总RNA。检测或测量特定mRNA转录物的方法也对本领域技术人员熟悉。这些测定无限制地包括使用可检测标记的cpn60特异核酸(DNA或RNA)探针的杂交测定和用适当cpn60寡核苷酸引物的定量或半定量RT-PCR方法。定量细胞裂解物中mRNA的另外方法包括RNA保护测定和系列分析基因表达(SAGE)。另外,能完成定性、定量或半定量原位杂交测定,使用例如样品如组织切片或未裂解细胞悬浮液、可检测(例如荧光、同位素或酶)标记的DNA或RNA探针。

如本文所用,cpn60特异多肽标记是包括所有或部分cpn60蛋白的多肽。用cpn60特异核酸,cpn60特异多肽标记可特异于特定微生物种类或通用。种特异cpn60特异多肽标记是所有或部分特定种的cpn60蛋白。在本发明方法中,检测标记的探针或分析方法应该能区分特定cpn60特异多肽与所有其它cpn60特异多肽,例如通过质谱应用中的质量或抗体测定中的特定抗原表位。例如,如下面更详细描述,本领域技术人员意识到能获得识别抗原表位的抗体,特别是单克隆抗体,抗原表位特异于特定种的cpn60蛋白。因此,在本文所述方法中使用这类特异抗体可差别检测样品中的特定种类。

一般,可通过发明方法检测的微生物包括细菌、原生动物、立克次氏体和真菌。代表性细菌微生物包括葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、埃希氏菌(Escherichia)、杆菌(Bacillus)、布鲁氏菌(Brucella)、衣原体(Chlamydia)、梭菌(Clostridium)、志贺氏菌(Shigella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、农杆菌(Agrobacterium)、巴尔通氏体(Bartonella)、疏螺旋体(Borellia)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、埃利希体(Ehrlichia)、嗜血杆菌(Haemophilus)、螺杆菌(Helicobacter)、阳光杆菌(Heliobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、根瘤菌(Rhizobium)、链霉菌(Streptomyces)、聚球蓝细菌(Synechococcus)、发酵单胞菌(Zymomonas)、集胞蓝细菌(Synechocyotis)、支原体(Mycoplasma)、耶尔森氏菌(Yersinia)、弧菌(Vibrio)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、弗朗西丝氏菌(Franciscella)、军团菌(Legionella)、沙门氏菌(Salmonella)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、肠球菌(Enterococcus)、肠杆菌(Enterobacter)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、拟杆菌(Bacteroide)、普雷沃尔氏菌(Prevotella)、黄单胞菌(Xanthomonas)、木杆菌(Xylella)和弯曲杆菌(Campyiobacter)属。代表性原生动物微生物包括棘阿米巴虫(Acanthamoeba)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和四膜虫(Tetrahymena)属。代表性真菌微生物包括曲霉菌(Aspergillus)、刺盘孢霉菌(Colletrotrichum)、旋孢腔菌(Cochliobolus)、长蠕孢菌(Helminthosporium)、微环菌(Microcyclus)、柄锈菌(Puccinia)、梨孢(Pyricularia)、次茎点霉菌(Deuterophoma)、丝梗孢(Monilia)、假丝酵母(Candida)和酵母(Saccharomyces)。代表性立克次氏体微生物包括伯氏考克斯氏体(Coxiellaburnetti)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、五日热罗卡利马氏体菌(Rochlimea Quintana)、五日热立克次氏体(Rickettsia Quintana)、普氏立克次氏体(Rickettsiap rowasecki)和立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)。

应理解本发明不受1种或多种可商业购买仪器的配置的限制。

高风险环境如本文所用,高风险环境是被1种或多种微生物污染的风险环境,这是由于其中所进行活动的性质或由于环境是微生物的潜在来源。高风险环境包括但不限于下列:零售食品式工业设施、学校、医学环境、水设备、住宅、易腐食品或不适当保存的食品、运输设备、加工设施和研究设施。例如,零售食品业传统上是严重的传染性爆发源,且是一种高风险环境类型的例子。零售食品业场所包括地方如屠宰店、杂货店、餐馆、自助餐厅、娱乐场所和便利店。

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